Tóm tắt

Mục tiêu: Tối ưu hóa quá trình thu nhận tế bào đơn nhân máu ngoại vi (peripheral blood mononuclear cell - PBMC) và quá trình chuyển nạp tạo tế bào CAR-T. Đối tượng và phương pháp: Máu ngoại vi từ người hiến tặng khỏe mạnh được tiến hành tách PBMC bằng FicollPaque. Phản ứng chuyển nạp tạo khối tế bào CAR-T được thực hiện ngay sau khi thu nhận PBMC hoặc sau khi kích hoạt tế bào bằng bi từ gắn kháng thể kháng CD3 và CD28. Các thông số: Hệ thống chuyển nạp, số lượng tế bào cho một phản ứng và lượng plasmid DNA được tối ưu hóa. Kết quả: Máu pha loãng 2 lần với PBS 1X cho hiệu suất thu nhận PBMC và tỷ lệ tế bào sống cao nhất. Thực hiện phản ứng chuyển nạp trên hệ thống Nucleofector 2b (Lonza) với 2 × 107 PBMC không kích hoạt, lượng plasmid DNA 1 µg SB100X và 10 µg pSB-CAR19 cho kết quả tốt nhất. Kết luận: Tối ưu hóa được quá trình tách PBMC và chuyển nạp tạo khối tế bào CAR-T cho điều trị lơ-xê-mi cấp dòng lympho. * Từ khóa: CAR-T, CD19; Tế bào đơn nhân máu ngoại vi; Chuyển nạp; Hệ thống Sleeping Beauty.

Abstract

Objectives: To optimize isolation and nucleofection (based on Sleeping Beauty system) of peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Materials and methods: PBMCs were isolated from peripheral blood of healthy donors using Ficoll-Paque. Different dilutions of whole blood and PBS 1X were tested. Nucleofection was performed on either unstimulated PBMC or stimulated PBMC (using CD3/CD28 dynalbeads). Parameters including nucleofector, number of cells, and amount of DNA substrate were optimized. Results: The best result was obtained when 2 × 107 unstimulated PBMCs were nucleofected using Nucleofector 2b, 1 µg sSB100X, and 10 µg pSB-CAR19. Conclusion: We have successfully developed an optimized protol for PBMC isolation and nucleofection for development of anti-CD19 CAR-T cells. * Keywords: CAR-T; CD19; Peripheral blood mononuclear cell; Nucleofection; Sleeping Beauty system.